概述

熒光顯微鏡的基本原理是借助熒光染料對細胞成分進行高度特異性的可視化觀察。這可能是一種與興趣蛋白質遺傳相關的熒光蛋白，如綠色熒光蛋白（GFP）等。如果克隆無法實現，例如在組織學樣本上無法實現，則需要使用另一種技術如免疫熒光染色來對興趣蛋白質進行可視化觀察。為此，人們使用抗體來連接不同的熒光染料并將其直接或間接地結合到適當的靶點上。此外，借助熒光染料，熒光顯微鏡的應用就不再僅局限于蛋白質觀察，還能對核酸、多糖和其他結構進行染色，甚至像鈣離子這樣的非生物物質也能被檢出。本文就為大家介紹了幾種常用的熒光染料。

免疫熒光
在熒光顯微鏡下，有兩種方法可以顯示興趣蛋白質?？梢越柚鷥仍诘臒晒庑盘枺簿褪峭ㄟ^克隆從而在基因層面把一個熒光蛋白和一個靶蛋白聯系起來；又或者借助熒光標記的抗體特異性結合到興趣蛋白質上。對于某些生物學問題來說，后者更為實用甚至更為必要。例如，在組織學樣本的情況下，通常樣本來自不含任何熒光蛋白的生物體，所以不可能使用熒光蛋白。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術要快得多，因為熒光蛋白方法必須克隆興趣基因并將DNA轉染到相應細胞中。熒光蛋白的另一個缺點在于其本身就是一種蛋白質。因此細胞內就具備了特定的蛋白質特性，因而可能導致功能紊亂或對所結合的興趣蛋白產生干擾。當然，值得注意的是，熒光蛋白通常是觀察活細胞的方法。

免疫熒光利用抗體對抗原的特異性結合親和力。此處可存在兩種不同的結構。簡單的方法是使用一種熒光標記的抗體，該抗體與興趣蛋白結合，稱為直接免疫熒光。

大多數情況下會使用兩種形式的抗體。第1抗體與靶蛋白結合，自身（1st抗體）沒有熒光標記。但與第1抗體結合的第2抗體（2nd抗體）特異性攜帶熒光染料，這種方法被稱為間接免疫熒光。間接免疫熒光有幾個優點，一方面會存在放大效應，因為不止有一種第2抗體與一種第1抗體結合。另一方面，針對您興趣蛋白，不需要一直用熒光染料標記每種抗體，可以使用市售熒光標記的第2抗體。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料是FITC、TRITC或以下提到的幾種Alexa Fluor®染料。

FITC和TRITC
異硫氰酸熒光素（FITC）是一種有機熒光染料，目前仍用于免疫熒光和流式細胞術當中。該染料在495/517nm處存在激發/發射峰，而且可借助其反應性異硫氰酸酯基團與蛋白質上的氨基、巰基、咪唑基、酪氨?；螋驶Y合而與不同的抗體偶聯。它的基本結構，即熒光黃的分子量為332g/mol，常用作熒光示蹤劑。FITC（389g/mol）是最早用于熒光顯微術的染料之一，也是Alexa-fluor488等熒光染料的來源。它的熒光活性源于其自身的大共軛芳香電子結構，在藍色光譜中會被光所激發。

圖 1： 果蠅胚胎發育，綠色： FITC，紅色： TRITC。
經常與FITC配合使用的一種染料是同出一門的TRITC（四甲基羅丹明-5-（和6）-異硫氰酸酯）。與FITC不同，TRITC不是熒光素，而是羅丹明系列衍生物。羅丹明也存在一個大的共軛芳香電子結構，因此可以發出熒光。與FITC不一樣，TRITC（479g/mol）在綠色光譜中被激發，最大值出現在550nm處，最大發射波長為573nm。與蛋白質（如抗體）的結合也基于反應性異硫氰酸酯基團。

即使FITC和TRITC仍在使用，但考慮到兩者屬于相當弱的熒光染料，不建議用于先進的顯微術。兩者的優勢主要還是在于成本低。

花青素
這種相對較小的熒光染料集合源于花青素并因此而得名：Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。這些染料都可以通過反應基團與核酸或蛋白質相連。例如，蛋白質標記使用馬來酰胺基團。有趣的是，熒光方面Cy5對周圍的電子環境很敏感，這可用于酶的測定。黏附蛋白的構象變化導致熒光發射的正負變化。此外，Cy3和Cy5可用于FRET實驗?；ㄇ嗨厝玖鲜潜容^古老的熒光染料，也是其它熒光染料的基礎，具有亮度高、光穩定性好、量子效率高等優點。

圖 2： 小鼠轉基因胚胎、肢間體節、E10.5小鼠轉基因胚胎的5個肢間體節： EpaxialMyf5 eGFP；GFP-Alexa 488免疫組化染色；用Desmin-Cy3對胚胎肌肉纖維進行染色，用Hoechst揭示細胞核，自上而下尺寸： 3.5毫米 (a)、800微米 (b)。 樣本提供： Aurélie Jory，法國巴黎巴斯德研究院干細胞與發育以及遺傳與分子細胞生物學研究所 (IGBMC) 成像中心

圖 3： 小鼠成纖維細胞，綠色： F-Actin、FITC，紅色： Tubulin、Cy5，藍色： 細胞核，DAPI。 樣本提供： 德國海德堡馬克斯-普朗克醫學研究所 Günter Giese 博士
DNA染色處理
在熒光顯微術中，不僅蛋白質結構感興趣，而且對核酸也感興趣。有時有必要通過檢測細胞核來確定細胞的確切位置或數量。最常見的DNA染色劑之一是DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吲哚），主要與DNA雙螺旋富含A-T的區域結合。與未結合態相比，DAPI在DNA上的熒光強度增加。染料被UV（紫外線）光激發，最大激發波長為358nm。發射光譜較寬，峰值在461nm。弱熒光也可以檢測到RNA結合。在這種情況下，發射轉移到500nm。有趣的是，DAPI能夠滲透完整的細胞膜。因此，該染料既可用于固定細胞也可用于活細胞。

第二種廣泛使用的DNA染色方法是Hoechst染料，最初由化學公司Hoechst AG生產。Hoechst 33258、Hoechst 33342和Hoechst 34580都是鄰苯二甲酰亞胺，具有向A-T富集區插入的趨勢，因此后者不常使用。與DAPI相似，此類染料受到紫外線激發并在455 nm下發射最大值，在無結合狀態下變為510–540 nm。Hoechst染料還具有細胞滲透作用，因此可用于固定細胞和活細胞。與DAPI不同是，Hoechst染料毒性更低。

DNA染色劑碘化丙啶無法透過細胞膜。在細胞培養中，因為該染色劑無法進入完好的細胞內，所以常常被用來區分活細胞和死細胞。碘化丙啶也是一種結合劑，但對不同的堿基沒有特異性。在核酸結合態下，其最大激發波長為538nm，最高發射波長為617nm。未結合狀態下碘化丙啶的最大激發和發射被移到較短的波長和較弱的強度。它也可以在不改變其熒光特性的情況下與RNA結合。要區分DNA和RNA，必須使用足夠的聚合酶。

吖啶橙是一種染料，可以在DNA和RNA之間形成差異區分而無需事先操作。其最大激發/發射對在DNA結合態為502nm/525nm，在RNA結合態為460nm/650nm。此外，該染料還可以進入酸性間室中，如溶酶體。陽離子染料在酸性間室中質子化。在酸性環境中，吖啶橙受藍色光譜中的光激發，而橙色區域的發射*。因為凋亡細胞有很多被吞噬的酸性間室，因此也讓該染料成為了這類細胞常用的標記物。

間室與細胞器特異性染料
在熒光顯微鏡下，對細胞間室如溶酶體或核內體和細胞器如線粒體等進行染色通常較為合理。為此，本節將介紹一組特定染料組合。

觀察線粒體時一種*的方法是使用MitoTracker®。這是一種細胞滲透性染料，具有溫和的巰基活性氯甲基部分。該染料可以通過與半胱氨酸殘基的自由巰基反應，與基質蛋白共價結合。MitoTracker®有不同的顏色和改良成分（見表1），也是Molecular Probes的商標。與傳統的線粒體特異性染色劑如羅丹明123或四甲基玫瑰胺不同的是，在用固定劑破壞膜電位后MitoTracker®不會被洗掉。

根據線粒體染色情況，還有染料標記酸性間室如溶酶體等，稱為LysoTracker。這些是與熒光團相連的膜滲透性弱堿。由于質子化作用，這些堿很有可能與酸性間室有親和力。LysoTracker也有不同的顏色（見表1）。

與溶酶體類似的間室為真菌液泡，如釀酒酵母。這種薄膜包圍的空間也具有酸性。在熒光顯微鏡下觀察它的方法之一是使用苯乙烯基染料，如FM 4-64®或FM 5-95®。

在蛋白質分泌實驗方面，內質網（ER）尤為值得注意。對這種間室進行染色的一種經典染料是DiOC6(3)。這種染料雖然偏向與內質網結合，但也能與線粒體膜等其他膜結合。另一種特定染色ER的方法是使用ER-Tracker，如綠色和紅色ER-Tracker。這兩種染料都是以BODIPY為基礎的染料，與格列本脲（一種磺酰脲酶）有關，能與ER膜上*的ATP敏感鉀通道結合。BODIPY（硼二吡咯甲基）描述了一組相對pH不敏感的染料，這些染料幾乎都不溶于水。這類染料并不是很好的蛋白質標記工具，但用于脂質和膜標記時效果較佳。

ER相近間室 – 高爾基體 – 可用熒光神經酰胺類似物如 NBD C6-神經酰胺和BODIPY FL C5-神經酰胺進行標示。神經酰胺是高爾基體中所富含的鞘脂。

在進一步脂質基染料的幫助下還有可能對特殊的膜區域，如脂質筏等進行染色。這些富含膽固醇的結構域可以通過使用NBD-6膽固醇或NBP-12膽固醇等（Avanti極性脂質）來進行可視化觀察。

除了使用特殊的非蛋白熒光染料來標記細胞間室外，還可以借助于對細胞中不同位置有偏好的蛋白質來染色興趣區域。這些蛋白質可以連接到熒光染料上，并在熒光顯微鏡下顯示出來。這種方法的一個例子是小麥胚芽凝集素（WGA）的使用，它與存在于質膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特異結合。WGA與熒光染料偶聯。用它可以觀察到質膜。

圖 4： Pukinje細胞，三色標記的小鼠小腦皮質矢狀切片。 紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3，綠色：anti-GFAP/Cy5，藍色： Hoechst 33258

圖 5： 牛肺內皮細胞。 紅色： MitoTracker® Red CMXRos 標記的線粒體，綠色： 綠色熒光BODIPY® FL phallacidin標記的纖維狀肌動蛋白，藍色： DAPI 標記的細胞核。 此圖像采用3D盲反卷積方法提高了圖像質量
ER相近間室 – 高爾基體 – 可用熒光神經酰胺類似物如NBD C6-神經酰胺和BODIPY FL C5-神經酰胺進行標記。 神經酰胺是高爾基體中所富含的鞘脂。

在其他脂質基染料的幫助下還可以對特殊的膜區域如脂質筏等進行染色。 這些富含膽固醇的結構域可以通過使用NBD-6 膽固醇或NBP-12 膽固醇等（Avanti極性脂質）來進行可視化觀察。

還可以借助于對細胞中不同位置有偏好的蛋白質來染色感興趣區域。 這種方法的一個例子是小麥胚芽凝集素(WGA)的使用，它與存在于質膜中的唾液酸和N-乙酰氨基葡萄糖基特異結合。

功能實驗
“功能實驗"是一個統稱，指的是評估各種功能的標準化實驗，這些功能可以用熒光標志物進行可視化觀察。 這些標志物包括但不限于上述任何標記技術和熒光團。 對于其中的許多功能實驗而言，染色試劑盒可在市場上買到，并且可以輕松用于各種樣本。 功能實驗的一個例子是大家都知道且廣泛使用的活細胞/死細胞實驗。 兩個熒光團分別用于標記活細胞和死細胞。 在同時掌握這兩個值的情況下，就可以評估細胞的總體健康狀況。 將此信息與其他標志物關聯起來還可以加深對底層過程的理解。


圖 6： Alexa 488（綠色曲線）和 Alexa 555（黃色曲線）的熒光發射曲線。 兩個發射光譜的重疊顯而易見。 紅線表示 488 發射光濾光鏡的帶通。