使用共聚焦顯微鏡的三維定位工作流程
在下文中，描述了在3D冷凍共聚焦顯微鏡中識別熒光目標結構的工作流程，以及如何在冷凍FIB-SEM中檢索熒光目標結構，目的是以更可靠的方式將其保留在最終FIB薄片中，以便在冷凍TEM中進行進一步研究。
為了評估冷凍EM網格和樣本的質量，先創建一張相機概覽圖像。使用透射或反射顯微模式，可以看到載網碳膜是否完整（圖1）。
圖1：EM網格——質量評估和靶分布。以A9細胞為例。左圖：通過反射成像觀察到的網格方格?？梢妰蓚€玻璃化細胞；在細胞下方可以觀察到碳膜上的裂紋。中間圖：透射光下相同的網格方格。其它信息，如冰晶污染，變得可見。右圖：相同細胞顯示Alexa Fluor 488 Phalloidin以綠色標記纖維狀肌動蛋白（F-actin），細胞核以紅色用DAPI染色。3D成像堆棧的圖像投影。比例尺：10 µm.
同時，可以判斷有關細胞及其相對于網格方格的位置的信息。在隨后的EM步驟中，只能評估網格方格中心附近的目的細胞。為了改善細胞的定位，可以在將細胞接種到載網碳膜上之前應用微排布技術[3]。
在下文中，基于未發表的圖像（德國海德堡EMBL的Herman Fung和Julia Mahamid提供）和《核孔的在細胞內的原位結構及其轉換的快照》中的數據[1]，詳細解釋了3D冷凍靶向過程。
有關載網碳膜完整性的信息，以及熒光樣品在網格方格內合適的位置，有助于選擇合適的FIB研磨位置（圖2）。
圖2：透射光模式和熒光模式的概覽圖像。具有表達核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus（紅色）和校準珠子（紅色，強信號，圓形，1µm）的酵母細胞。結合載網碳膜質量信息，可以確定FIB銑削的合適位置。綠色框表示以下步驟中使用的區域。載網旋轉調整為FIB視圖（見下文）；比例尺：20 µm.
在為FIB銑削選擇相關位置后，在這些位置沿光軸創建一系列熒光圖像以獲得3D信息。與普通寬場系統相比，要是想提高z方向的分辨率，共聚焦顯微鏡是方法。通過激光逐點掃描樣品，只記錄熒光發射的聚焦信息。然后，將在不同z位置記錄的2D圖像組合成3D堆棧（圖3）。
圖3：共焦z堆棧的三維顯示。記錄了與圖2所示相同的網格方格。校準珠子在綠色和紅色區域中顯示出強烈的熒光，但仍然可以通過信號的強度和形狀進行區分。核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus僅以紅色顯示。后續FIB銑削的靶位置之一由放大框中的箭頭指示。
顯微鏡系統的軸向分辨率主要取決于所用物鏡的開啟角度（所謂的數值孔徑）。由于商品化冷凍顯微鏡為方便使用者而使用空氣物鏡（不需要浸入，可能會影響樣品的玻璃化狀態），因此實際分辨率有限。xy的典型分辨率為200 nm，z的分辨率約為800 nm。
為了能夠正確定位感興趣的細胞位置，可以將校準珠子作為參考結構應用于樣品，以便在3D中對齊和關聯熒光和EM圖像[4]。
典型的珠子尺寸為1µm，呈球形，這使其中心坐標能夠進行亞衍射擬合。通過SEM中的背散射電子，可以更清晰地觀察到含有金屬的微珠，從而將它們與大小相似的冰晶區分開來。優先選擇熒光發射光不同于實際目標結構的熒光發射光的珠子，以便能夠更好地區分（圖4）。
圖4：坐標變換原理。使用基準點作為支撐點，將靶坐標從光學顯微鏡轉移到FIB-SEM。黃色：校準珠子；紅色：Nup159-Atg8-split Venus.左圖：共聚焦圖像的投影，圓圈標記示例性珠子和箭頭標記目標NUP。中心圖像：用相同珠子標記的SEM圖像。右圖：通過在兩種模式中疊加珠子信息創建疊加熒光信號和SEM信號的圖像。因此，目標位置被投射到SEM圖像中。比例尺：20 µm.
由于基準點在LM和SEM中都可見，因此它們的坐標可用于在兩種模式之間轉換旋轉、平移和縮放等參數。然后，可以將共聚焦顯微鏡中標記的靶坐標轉換為FIB銑削過程，以增加獲得FIB薄片中具有感興趣結構的概率。
然而，用于精確3D定位的商業軟件解決方案尚未開發，但基于上述出版物（3D Correlation Toolbox），有一個開源解決方案可用。
使用3D Correlation Toolbox，可以加載共聚焦圖像數據，標記靶和校準珠子，并自動確定其中心坐標。然后將定義的坐標標記投射到FIB圖像上，以定義銑削的xyz坐標（圖5）。
為了將靶區域研磨成適當薄的體積，感興趣結構的上方和下方各設定一個銑削窗口，如熒光信號投射到FIB圖像上所示（圖5）。然后施加鎵離子束，并削除相應窗口中的材料?？梢栽谝粋€EM網格上創建多個薄片，從而提高工作流的效率。
圖5：熒光在FIB圖像上的投影，用于精密銑削。左圖：銑削前樣品的FIB視圖與共聚焦投影的疊加。箭頭表示靶NUP結構。黃色：校準珠子；紅色：Nup159.Atg8-split-Venus.中心圖像：在關聯共焦和FIB圖像之間的珠子位置后，在FIB視圖上疊加共焦圖像平面。箭頭表示下薄片上的靶結構。右圖：研磨后共聚焦圖像投影和SEM視圖的疊加。產生的薄片中含有目標結構熒光（見箭頭）。
為了以分子分辨率獲得樣品的結構信息，使用冷凍透射電子顯微鏡對冷凍樣品薄片進行成像。通過在薄片的SEM和TEM視圖之間進行配準，可以根據薄片中包含的目標熒光信號確定傾斜序列采集區域。然后將成像的傾斜序列進行計算組合，以重建細胞內部的三維體積。通過對許多同類單個蛋白的結構信息進行平均（亞層析平均），可以獲得更好的大分子解析結構。在圖6中，圖5所示的下薄片由冷凍ET成像。斷層照片的分割結果顯示了核膜與靶NUP位置。
結 語
本文表明，冷凍共聚焦顯微鏡是冷凍工作流程中的一個重要組成部分，用于評估EM載網上玻璃化樣品的質量和目標結構分布。在冷凍條件下記錄的高分辨率共聚焦數據使科學家能夠在3D熒光下定位感興趣結構。3D體積圖像可作為光電關聯的參考，以檢索FIB-SEM中的目標結構進行銑削，隨后在冷凍TEM中進行電子斷層掃描，以獲得目標結構在其原生細胞環境中的高分辨率圖像。
